蛋白定量檢測試劑核心作用與重要性

更新時間：2025-11-22 點擊次數(shù)：269

　蛋白定量檢測試劑的作用是快速、準確地測定溶液中蛋白質(zhì)的濃度。

　　一、核心作用與重要性

　　1、標準化實驗：在許多生物學實驗中，如WesternBlot、ELISA、細胞轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)純化等，需要確保每個反應中加入等量的蛋白質(zhì)。蛋白定量是保證實驗結果可比性、可重復性和準確性的第一步。

　　2、評估樣品質(zhì)量：在蛋白質(zhì)純化過程中，通過測定不同步驟中蛋白質(zhì)的濃度，可以計算回收率、純化倍數(shù)，從而評估純化方法的效率。

　　3、診斷與醫(yī)療應用：在臨床檢驗中，測定血液、尿液等體液中的特定蛋白質(zhì)（如白蛋白、免疫球蛋白）濃度，是診斷多種疾?。ㄈ绺文I功能異常、營養(yǎng)狀況、免疫疾?。┑闹匾笜?。

　　二、工作原理

　　蛋白定量試劑的核心原理是利用蛋白質(zhì)的特定化學性質(zhì)或氨基酸殘基與染料發(fā)生反應，產(chǎn)生可檢測的信號（通常是顏色變化或熒光變化），這個信號的強度與蛋白質(zhì)的濃度成正比。

　　主要的原理包括：

　　- 還原銅離子反應：蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下將Cu??還原為Cu?，后者與試劑中的其他物質(zhì)反應生成有色絡合物。

　　- 與特定氨基酸反應：與蛋白質(zhì)中的精氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸或堿性氨基酸發(fā)生反應。

　　- 染料結合：某些染料與蛋白質(zhì)結合后，其吸光度或熒光性質(zhì)會發(fā)生改變。

　　- 紫外吸收：蛋白質(zhì)中的色氨酸和酪氨酸在280nm處有特定的紫外吸收峰。
　　三、常見的蛋白定量檢測方法及對應試劑

方法名稱	常用試劑	原理	優(yōu)點	缺點	適用場景
BCA法	BCA試劑盒	蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境下將Cu²?還原為Cu?，Cu?與BCA試劑反應生成紫色絡合物（562nm）。	- 靈敏度高	- 不同蛋白質(zhì)因氨基酸組成不同，顯色有差異	常用、通用的方法之一，尤其適用于含有去垢劑的細胞裂解液樣品。
			- 抗干擾能力強（對去垢劑耐受性好）	- 反應時間較長
			- 操作簡便
Bradford法	考馬斯亮藍G-250染料	染料與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸和芳香族氨基酸結合，顏色由棕紅色變?yōu)樗{色（595nm）。	- 非?？焖伲?/span>~5分鐘）	- 對去垢劑非常敏感（如SDS、Triton）	適用于成分簡單、不含干擾去垢劑的純化蛋白樣品。
			- 靈敏度高	- 不同蛋白質(zhì)差異大
			- 成本較低	- 染料易附著在器皿上
Lowry法	Folin-酚試劑	第一步與BCA類似（銅離子反應），第二步與Folin-酚試劑反應，增強信號。	- 靈敏度高于BCA法	- 步驟繁瑣	經(jīng)典方法，現(xiàn)多被BCA法取代。
				- 干擾物質(zhì)多
				- 現(xiàn)已較少使用
紫外吸收法	無特殊試劑，直接測量	利用蛋白質(zhì)中Trp和Tyr在280nm的紫外吸收。	- 無損樣品，可回收	- 受核酸污染干擾嚴重（核酸在260nm有強吸收）
			- 極其快速簡便	- 需要蛋白質(zhì)含有芳香族氨基酸
			- 無需制作標準曲線

　　四、標準操作流程

　　無論使用哪種試劑，基本流程都遵循以下步驟：

　　-制備標準品：用已知濃度的標準蛋白（通常是牛血清白蛋白BSA）配制一系列梯度濃度的溶液。

　　-與試劑反應：將標準品和待測樣品分別與定量試劑混合，在特定溫度下孵育一定時間。

　　-檢測吸光度：使用酶標儀或分光光度計測量各管在特定波長下的吸光度值。

　　-繪制標準曲線：以標準蛋白濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

　　-計算未知濃度：將待測樣品的吸光度值代入標準曲線的回歸方程，計算出其蛋白質(zhì)濃度。